pcr產物的電泳檢測時間
一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
pcr反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特 異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
假陽性
出現(xiàn)的pcr擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行pcr擴增 時，擴增出的pcr產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽 性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本 前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴 增出pcr產物，而導致假陽性的產生，可用巢式pcr方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴增帶
pcr擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不互補、或引物聚合形成二聚體。二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr循環(huán)次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引 物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。